换一批
换一批SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测人c-myc基因方法的建立
A Sensitive and Specific Method of Real-time Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction Using SYBR GreenⅠ for Detection of c-myc Gene
摘要目的 构建含有c-myc基因的重组质粒并以其为模板,建立以SYBR GreenⅠ染料为荧光指示剂的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术检测c-myc的标准曲线,为FQ-PCR准确检测c-myc奠定基础.方法 用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法从人食管鳞癌组织的总mRNA中反转录扩增c-myc cDNA,将纯化的PCR产物与pGEM-T Easy载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,然后挑选阳性克隆重组质粒,分别用PCR扩增、限制性核酸内切酶EcoRⅠ酶切进行鉴定并测序分析.用紫外分光光度计测质粒浓度,计算拷贝数制备FQ-PCR浓度梯度标准品.最后对质粒标准品进行FQ-PCR检测.结果 PCR扩增、酶切鉴定及测序分析均证实c-myc重组到pGEM-T Easy 载体上.建立了人c-myc标准曲线,其对数与相应的Ct值(循环阈值)具有良好的相关性,相关系数r2=-0.99～-1,斜率为-3.1～-3.6.结论 所构建的人c-myc质粒标准品应用SYBR GreenⅠ荧光染料技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏性和特异性高,准确可靠,此方法可作为FQ-PCR检测c-myc基因的标准方法.
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分类号
Q78
栏目名称
基础研究
DOI
10.3969/j.issn.1006-7795.2009.06.022
发布时间
2010-03-23
基金项目
北京市自然科学基金
北京市教委科技发展计划面上项目
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