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人NKp46基因克隆及其在大肠杆菌中的表达和纯化

Cloning of human NKp46 gene and its expression and purification in E.coli

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摘要目的:对人NKp46进行基因克隆并探讨其在大肠杆菌中重组表达和纯化.方法:用RT-PCR法自人外周血单个核细胞总RNA扩增hNKp46片段(约900 bp),克隆至质粒载体pMD18-T,并对克隆的DNA片段进行序列分析.用限制酶EcoRⅠ和NcoⅠ消化pMD18-T-hNKp46重组质粒,分离hNKp46片段,并插入原核表达载体pET30a(+)的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pET30a(+)-hNKp46.转化菌株BL21(DE3)经IPTG诱导,用SDS-PAGE和Western Blotting鉴定表达的重组蛋白.采用His·Bind Purification Kit对重组蛋白进行纯化.结果:RT-PCR扩增的DNA片段与hNKp46 cDNA大小一致.重组质粒pMD18-T-hNKp46的DNA序列分析显示,克隆的DNA序列与文献报道的hNKp46的cDNA序列一致.SDS-PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为38.5 kD,其表达量达菌体总蛋白的40%左右.Western Blotting分析显示,重组蛋白能特异地与抗His·Tag抗体结合.纯化得到纯度为95.5%的重组蛋白,纯化回收率达40%.结论:成功构建了人NKp46表达载体,并获得了稳定表达的工程菌株,纯化了重组蛋白.