非融合绿色荧光蛋白标记EV71型人肠道病毒的构建

Construction of EV71 genome labeled by non-fusion enhanced green fluorescent protein

二维码有效期 120s

摘要目的构建非融合绿色荧光蛋白(EGFP)标记的肠道病毒71型(EV71),为EV71抗病毒机制研究及抗病毒药物的筛选提供方法.方法取野生型病毒EV71,在EV71基因组的3D蛋白编码区后添加HBV的link序列,将EGFP基因连入link与EV71型病毒3′非翻译区之间,构建EGFP标记的EV71病毒基因组,并转染横纹肌瘤RD细胞以获得EV71-link-EGFP重组病毒.采用PCR方法鉴定重组病毒中link、EGFP位置.感染RD细胞后24、48、72、96、120、144和168 h时收获病毒,采用组织半数感染量法测定病毒滴度,绘制病毒生长曲线,比较重组病毒与野生型病毒的生长动力学.RT-PCR测定EGFP转录表达.将重组病毒感染RD细胞后72 h裂解,采用Western blotting法检测RD细胞中GFP、P1蛋白的表达情况.重组病毒感染RD细胞后,经过13轮传代,Western blotting法检测EGFP基因稳定性.结果 RD细胞内表达较强的GFP荧光,病毒感染细胞后病毒的mRNA正常表达,重组病毒中link序列、EGFP基因链接位置正常,证实EV71-link-EGFP重组病毒拯救成功.重组病毒滴度的曲线峰值与野生型病毒滴度的峰值相同.重组病毒中EGFP的表达在48 h时最高.重组病毒中GFP和P1蛋白表达正常稳定.经过13轮传代,第13代重组病毒表达的GFP蛋白与第1代无明显差别.结论通过添加link序列成功构建了非融合表达的EV71-link-EGFP重组病毒,可在RD细胞中良好生长并高效表达EGFP,且具有稳定的遗传性.