换一批稳定表达大电导钙激活钾通道α亚基的细胞株构建及其排钾的分子机制研究
Construction of stable cell lines expressing large conductance Ca2+-activated K+ channel α-subunit and molecular mechanism of potassium excretion in this channel
摘要目的·构建稳定表达大电导钙激活钾通道(large conductance Ca2+-activated K+channel,MaxiK或BK)α亚基的HEK293细胞株,探讨BKα通道的排钾机制.方法· 构建带Myc标签的BKα质粒,采用脂质体转染方法将BKα质粒转染至HEK293细胞系中,用药物G418筛选阳性单克隆细胞株,分别以Western blotting和细胞免疫荧光法检测BKα蛋白表达及定位.将稳定表达BKα蛋白的HEK293细胞系培养于玻片,形成单细胞层,分别给予5 mmol/L和100 mmol/L钾离子浓度的浴液,膜片钳单通道记录BKα的离子流.内向整流性钾通道Kir4.1的野生型和突变型(G77R、G130R、C140R和R297C)分别转染稳定转染BKα的HEK293细胞后提取膜蛋白,Western blotting检测BKα的表达情况.结果·转染后的HEK293细胞中挑选表达BKα通道的细胞株,细胞免疫荧光验证了BKα通道表达及其在细胞膜上表达.在给予100 mmol/L钾离子浓度浴液的情况下,BKα的通道开放频率(NPo)快速增加.Kir4.1的野生型和突变型分别转染稳定转染BKα的HEK293细胞后提取膜蛋白,Western blotting检测发现转染Kir4.1突变体质粒的HEK293细胞的BKα表达较野生型增加(P<0.05).结论· 成功地建立了稳定表达BKα的HEK293细胞株,BKα通道可以被高钾溶液激活;BKα通道的膜表达水平与Kir4.1通道功能状态有关,可能是由于突变的Kir4.1通道导致细胞去极化,从而激活BKα.
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医学主题词
钾(Potassium)细胞(Cells)转染(Transfection)离子(Ions)大电导钙激活钾通道(Large-Conductance Calcium-Activated Potassium Channels)
栏目名称
DOI
10.3969/j.issn.1674-8115.2019.10.007
发布时间
2019-12-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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