摘要目的·通过CRISPR/Cas9n(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 nickase)介导的同源定向修复(homologous-directed repair,HDR)技术在小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cell,mESC)的中内胚层关键调控分子T-box转录因子Brachyury(即T基因)末端依次敲入手足口病毒2A(foot-and-mouth disease virus 2A,F2A)和增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)以建立T荧光报告细胞系(mT-F2A-EGFP).方法·首先,针对T基因构建特异性单链导向RNA(single guide RNA,sgRNA)质粒和包含F2A-EGFP的供体质粒.利用电穿孔将这2种质粒递送到mESC E14Tg2a(E14)内,通过HDR在T基因末端插入F2A-EGFP.然后,通过药物筛选和基因测序验证所获得的单克隆细胞,并将其诱导形成类胚体(embryonic body,EB)进行分化.通过荧光显微镜和流式细胞技术分别监测mT-F2A-EGFP细胞克隆在分化前后的荧光信号变化,并进行实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-qPCR)来检测多能性标志基因、中内胚层以及外胚层标志基因的转录水平变化.同时,检测克隆细胞的周期、生长曲线,并利用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色检测候选克隆干细胞特性.最后,挑选克隆细胞系T1进行了EB分化.利用流式细胞技术分选出分化细胞群中EGFP荧光表达细胞(EGFP+)和无荧光表达的细胞(EGFP-),并检测各谱系基因的表达情况.结果·EGFP被正确插入到E14细胞的T基因,其荧光强度能正确反映T基因表达水平且未产生明显的不良反应.当T1报告克隆分化时,通过流式细胞技术分选出的包含mT-F2A-EGFP的荧光细胞主要高表达中内胚层标志基因.结论·成功构建携带mT-F2A-EGFP的mESC,可实现对T基因调控程度的快速监测,并实时追踪分化过程中表达T基因标记EGFP的中内胚层细胞.