摘要目的·利用纳米孔Cas9靶向测序(nanopore Cas9-targeted sequencing,nCATS)技术实现金黄色葡萄球菌的快速检测,并同时进行葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A,spa)分型和葡萄球菌盒式染色体mec(staphylococcal cassette chromosome mec,SCCmec)分型.方法·以spa基因和SCCmec基因元件作为靶向测序的2个目标区域(region of interest,ROI),设计4种CRISPR RNA(crRNA),使其构成的Cas9核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)能够靶向切割2个ROI两侧的序列;针对每种crRNA设计42 bp的模拟靶标DNA.通过Cas9 RNP切割效率测试,筛选合适的crRNA,优化切割体系,选择切割反应时间和Cas9 RNP合成温度.提取耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)菌株基因组DNA,末端去磷酸化,在切割后的ROI两侧末端加上dA尾,与测序接头连接后利用纳米孔机器进行测序.对测序结果数据的质量值进行分析,并将测得的核酸序列分别与mecA、spa和SCCmec数据库进行比对,根据比对结果判断样本中是否含有金黄色葡萄球菌,是否为MRSA,并同时获得其spa分型和SCCmec分型.结果·共设计出2组crRNA,经电泳图灰度分析,筛选出切割效率更高的一组用于后续实验.切割效率优化结果显示,Cas9 RNP与靶标DNA比例为1∶1,切割反应时间为15 min,Cas9 RNP合成温度为25℃时,Cas9 RNP切割效率可达87.41%.nCATS测序质量值集中在15(Q15)和20(Q20)之间,表明测序准确度约为99%.测序结果与mecA、spa和SCCmec数据库比对后得出菌株样本的spa分型为t2,并且是SCCmec Ⅱ型.相同菌株样本经PCR扩增后测序和多重PCR验证,结果均与nCATS结果一致.结论·利用nCATS技术能够实现金黄色葡萄球菌的快速检测,并能同时获得spa分型和SCCmec分型.