摘要目的·探讨组蛋白赖氨酸乳酸化(histone lysine lactylation,Kla)修饰对头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)中锌指蛋白668(zinc finger protein 668,ZNF668)的表达水平的调控作用,并探究ZNF668促进HNSCC细胞增殖的分子机制.方法·采用多重免疫荧光技术检测HNSCC患者癌及癌旁正常口腔黏膜组织微阵列中泛赖氨酸乳酸化(pan-lysine lactylation,PKla)修饰水平,并分析其与患者临床病理指标之间的关联性;通过Western blotting分析寻找外源性乳酸处理HNSCC细胞后调控Kla的特异性位点;借助靶向切割与转座技术(cleavage under targets and tagmentation,CUT&Tag)筛选Kla开放染色质基因,并结合RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)实验,在转录组水平检测乳酸刺激下HNSCC细胞的差异下游基因,进而筛选出Kla调控的下游特定靶基因;利用染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)实验,验证Kla对下游靶基因的可及性;通过Western blotting分析人正常口腔角质形成细胞(normal oral keratinocyte,NOK)与HNSCC细胞中ZNF668表达水平变化;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)验证NOK和HNSCC细胞中ZNF668 mRNA的表达水平;在无乳酸的对照条件下,通过Western blotting检测对乳酸刺激最敏感修饰位点和ZNF668的表达;通过5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine,EdU)和细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)法,检测敲低ZNF668对HNSCC细胞增殖能力的影响;通过Western blotting分析敲低ZNF668对WNT家族成员3(wingless-type MMTV integration site family member 3A,WNT3A)、β-连环蛋白(β-catenin)和G1/S-特异性周期蛋白-D1(cyclin D1,CCND1)蛋白表达的影响.通过免疫组织化学法(immunohistochemistry,IHC)检测乳酸刺激裸鼠皮下瘤中ZNF668表达及细胞增殖情况.结果·多重免疫荧光结果表明,HNSCC患者组织中的泛乳酸化修饰水平高于正常口腔黏膜,且高乳酸化修饰水平与患者TNM分期较晚有关.Western blotting结果显示,乳酸可促进HNSCC细胞的Kla修饰,其中H3K9 位点乳酸化(H3K9la)修饰变化最为显著.CUT&Tag联合RNA-seq筛选及ChIP-PCR验证结果表明,ZNF668是H3K9la下游的主要靶点之一.Western blotting和qRT-PCR分析结果显示,与NOK细胞相比,HNSCC细胞中ZNF668表达水平显著增高,且HNSCC细胞中H3K9la和ZNF668表达与乳酸刺激呈正相关.在HNSCC细胞中敲低ZNF668后,与对照组相比,细胞的增殖能力显著降低,同时WNT3A、β-catenin和CCND1蛋白表达量也呈下降趋势.IHC实验显示,裸鼠皮下瘤中乳酸刺激可促进ZNF668表达及细胞增殖.结论·Kla修饰可促进ZNF668表达,使其在HNSCC中发挥显著的促癌作用.ZNF668可能通过增强WNT3A/β-catenin/CCND1信号轴表达水平,进一步调控肿瘤细胞的增殖能力.