换一批摘要目的 利用冷冻电镜技术解析核小体与RFX7结合复合物的冷冻结构,阐明核小体与RFX7相互作用的具体方式.方法 利用pET28a表达载体和人源RFX7 eDBD(extended DNA binding domain)基因构建重组蛋白表达质粒pET28a-RFX7-eDBD,在原核蛋白表达感受态BL21(DE3)中表达蛋白,亲和层析获得蛋白,体积排阻色谱进一步分离纯化RFX7 eDBD蛋白.构建含有多拷贝人源RFX7特异性识别核小体DNA序列的质粒,转入大肠杆菌大量扩增DNA序列用于核小体组装.纯化4种组蛋白,组成组蛋白八聚体,利用盐透析法在体外装配核小体.通过EMSA凝胶迁移实验检测核小体与RFX7 eDBD的结合情况.负染电镜观察复合物蛋白状态并优化样品;冷冻电镜收集数据,冷冻电镜数据处理软件CryoSparc解析复合物的冷冻电镜结构,Chimera分析模型.结果 亲和层析成功纯化人源RFX7 eDBD蛋白以及4种组蛋白,并通过体积排阻色谱获得高纯度的RFX7 eDBD蛋白和组装好的组蛋白八聚体;聚乙二醇(PEG)6000沉淀法纯化DNA,利用盐透析法成功在体外组装核小体;EMSA凝胶迁移实验证实RFX7可以结合核小体,通过负染电镜、冷冻电镜及单颗粒重构技术解析了复合体的空间结构,初步确认了核小体与RFX7之间的相互作用.结论 RFX7具有核小体结合能力,利用冷冻电镜技术可以初步获得核小体与RFX7 eDBD蛋白复合体的空间结构模型.
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DOI
10.12289/j.issn.2097-4345.24074
发布时间
2025-01-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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