换一批人血管生成抑制素基因的克隆、表达载体构建及纯化
Cloning, construction and purification of recombinant human angiostatin gene
摘要目的克隆人血管生成抑制素基因(angtostatm),纯化其表达蛋白并初步检测纯化蛋白的生物学活性.方法用PCR技术从正常成人肝cDNA库扩增出人血管内皮抑素基因,将其克隆进pBluescript中,测定其核苷酸序列.构建大肠杆菌分泌性表达载体pET-22b(+)-angiostatin-6×His,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经Ni2+-IDA Sepharose 6B亲和纯化该表达蛋白,并采用血管内皮细胞增殖抑制实验检测其活性.结果经PCR扩增成功获得1 059 bp的人血管生成抑制素基因,测序正确,在大肠杆菌中表达后,该蛋白的表达量占菌体总蛋白的10%.SDS-PAGE和Western Blot显示其相对分子质量为39×103.经亲和纯化后的angiostatin-6×His纯度可达90%,得率为0.25 mg/100 ml,并且具有抑制血管内皮细胞增殖的活性,达到50%的抑制率,angiostatin-6×His浓度为800 ng/ml.结论人血管生成抑制素基因的克隆、表达及纯化,为采用抗血管生成方法治疗裸鼠肿瘤模型及肿瘤患者的研究奠定了基础.
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