换一批
换一批不对称荧光PCR扩增白念珠菌ITS-2基因单链DNA实验
Asymmetric fluorescence-PCR for the amplification of Candida albicans ITS-2 single-stranded DNA
摘要目的 比较在限制性引物不同稀释比例条件下,不对称荧光聚合酶链反应(PCR)扩增白念珠菌5.8S rDNA与28S rDNA间内转录间区2(ITS-2)基因的单链DNA(ssDNA)的实际效果,探讨其体系优化方法.方法 以常规PCR为对照,将20μmol/L的正向引物(P1)按照一定比例预稀释后,分别与20μmol/L的荧光标记反向引物(P2')组成含不同P1水平的引物对,采用不对称荧光PCR扩增真菌ITS-2,并对PCR产物进行电泳和测序分析,比较各实验组扩增ssDNA的效果.结果 不对称荧光PCR成功扩增出白念珠菌ITS-2基因的ssDNA,随着限制性引物水平的降低,ITS-2基因的双链DNA(dsDNA)条带逐渐变淡,而ssDNA条带逐渐变亮;在限制性引物稀释比例达到1:90~1:100时,dsDNA条带已经模糊不清,而ssDNA条带则达到最亮.提示在此扩增体系条件下,ssDNA拷贝数最多,为不对称荧光PCR扩增白念珠菌ITS-2基因ssDNA的最佳扩增条件.PCR产物测序也表明,dsDNA上方的条带为ITS-2基因的ssDNA.结论 通过优化限制性引物水平,不对称荧光PCR可以高效地扩增白念珠菌ITS-2基因的ssDNA.
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关键词
不对称荧光聚合酶链反应白念珠菌ITS-2基因单链DNAAsymmetric fluorescence-polymerase chain reactionCandida albicansInternal transcribed spacer 2Single-stranded DNA
分类号
R446.1
栏目名称
DOI
10.3969/j.issn.1673-8640.2017.03.013
发布时间
2017-04-24
基金项目
上海市卫生和计划生育委员会重点资助项目（20134010）；
上海市自然科学基金项目（15ZR1436100）
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