摘要目的 基于网络药理学、分子对接及体外实验探讨蟾毒灵逆转非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)奥希替尼耐药的作用机制.方法 通过Swiss Target Prediction数据库、CTD数据库、HERB数据库获得蟾毒灵的靶点,Gene Cards数据库收集奥希替尼耐药基因,Venn工具获取蟾毒灵和奥希替尼耐药的交集基因后导入STRING数据库,构建蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein interaction,PPI)网络,Cytoscape软件进行拓扑分析,DAVID数据库进行基因本体(Gene ontology,GO)富集分析及京都基因和基因组数据库(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析.采用AutoDock软件进行分子对接验证,PyMol软件进行可视化分析;通过分子动力学模拟分析蟾毒灵与靶蛋白结合的稳定性;以奥希替尼耐药细胞PC9OR为模型,采用蟾毒灵和/或奥希替尼进行干预,CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质印迹法(Western blotting,WB)检测相关信号通路蛋白质的表达变化;通过稳定过表达持续活化型蛋白激酶B(Protein kinase B,简称AKT)1(Myristoylated AKT1,myr-AKT1)开展功能挽救实验,进一步验证蟾毒灵作用的靶点依赖性.结果 获得蟾毒灵与NSCLC奥希替尼耐药20 个交集基因,KEGG分析显示主要富集于凋亡及PI3K-AKT等信号通路;分子对接和分子动力学模拟结果表明蟾毒灵与AKT1蛋白结合;体外实验结果显示,蟾毒灵显著抑制PC9OR细胞增殖并诱导细胞凋亡,下调p-AKT1和BCL2蛋白表达,上调BAX和cleaved caspase-3的表达;而在myr-AKT1过表达细胞中,蟾毒灵对AKT1磷酸化抑制、细胞增殖抑制及凋亡诱导作用明显减弱.结论 蟾毒灵可能通过靶向AKT1促进细胞凋亡从而逆转奥希替尼耐药.