可视化环介导等温扩增法检测牛奶中产志贺毒素大肠埃希氏菌

Determination of Shiga toxin-producing Escherichia coli in milk by visual loop mediated isothermal amplification

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摘要目的建立可视化环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)法检测牛奶中产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC).方法以stx1/2基因作为检测靶基因,利用羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue,HNB)指示剂,建立一种可视化检测STEC的LAMP方法.同时,将建立好的LAMP方法与聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法相比较,并对人工污染STEC的脱脂乳进行检测.结果建立的可视化LAMP方法在64℃反应50 min后可凭肉眼观察(紫罗兰色到天蓝色)判定结果.该方法特异性良好,与大肠埃希菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等均无交叉反应,可以准确区分STEC与非STEC菌.Stx1-LAMP和stx2-LAMP的检出限分别为3.54×10-4和3.54×10-5 ng/μL,而常规PCR中stx1和stx2的检出限分别为3.54×10-3和3.54×10-2 ng/μL,即stx1-LAMP检测方法的灵敏度是stx1-PCR的10倍,stx2-LAMP检测方法的灵敏度是stx2-PCR的1000倍.对人工污染STEC菌牛奶样品进行检测,stx1-LAMP和stx2-LAMP分别可检测到细菌浓度为103和102 CFU/mL的加标样品.结论本研究为STEC菌株提供了一种特异性强、灵敏度高、成本低,适用于现场和基层检测的可视化LAMP检测方法.