摘要3-岩藻糖基乳糖(3-fucosyllactose,3-FL)是一种典型的人乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs),在婴幼儿生长和大脑发育方面具有重要生理功能.本研究采用代谢工程的方法改造大肠杆菌BL21star(DE3),实现3-FL的高效生物合成.将幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)来源的α-1,3-岩藻糖基转移酶基因futA和脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)来源的L-岩藻糖激酶/二磷酸鸟苷-L-岩藻糖焦磷酸化酶基因fkp共同导入初始菌株BLW(Escherichia coli BL21star(DE3)ΔlacZΔwcaJ)中,摇瓶发酵3-FL的产量为1.01 g/L.利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除L-岩藻糖代谢途径的相关基因,包括L-岩藻糖异构酶基因fucI、L-岩藻糖激酶基因fucK和鼠李糖异构酶基因rhaA,3-FL的产量增加到1.36 g/L.筛选到幽门螺杆菌NCTC11637来源的α-1,3-岩藻糖基转移酶FT1合成3-FL的效果最好,表达FT1重组菌BLWFR-T的3-FL产量提升到1.56 g/L.随后优化通路基因的表达水平,采用质粒pETDuet-1表达fkp,质粒pRSFDuet-1表达FT1得到重组菌BLWFR-T2的3-FL产量提高到2.58 g/L.增强辅因子三磷酸鸟苷的再生,过表达肌苷鸟苷激酶基因gsk和鸟苷酸激酶基因gmk的重组菌BLWFR-T7的3-FL产量最高,达3.01 g/L.BLWFA-T7在5L发酵罐中分批补料发酵78h后的3-FL产量达到最高,为27.82 g/L.该研究为微生物发酵法高效合成3-FL及其他HMOs提供了研究基础.