摘要D-塔格糖是一种稀有的具有特殊保健功能的天然食品甜味剂.目前,以D-半乳糖为底物,基于异构化途径的D-塔格糖生物合成受到基本的热力学平衡限制,底物转化率较低;而基于氧化还原途径,可通过热力学耦合辅因子避免不必要的逆反应,具有更高的理论转化率;但现有氧化还原途径中关键酶醛糖还原酶底物谱广,对D-半乳糖底物特异性低,是制约此合成工艺发展的瓶颈.该研究以Scheffersomyces stipitis CBS 6054 来源木糖还原酶(xylose reductase,XR)SsXR为模板,基于氨基酸同源性分析,从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)中筛选出11 个同源序列,并分别对其进行同源建模和分子对接,以D-半乳糖与蛋白分子的结合自由能、作用位点处氨基酸距离为主,结合底物在蛋白口袋中的深度及契合程度等要素筛选到对D-半乳糖特异性最佳的Spathaspora gorwiae来源SgXR.将SsXR和SgXR分别引入大肠杆菌中异源表达并进行酶学性质研究.结果显示,二者均为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氢(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate hydrogen,NADPH)偏好,SgXR对D-半乳糖的底物亲和力是SsXR的 4 倍,其Km 值与kcat分别为SsXR的1/4 与1.11 倍;进一步引入来源Rhizobium legumenosarum的半乳糖醇脱氢酶RlGDH,以10g/L D-半乳糖为底物,发酵48 h,含有SgXR的重组菌D-塔格糖产量达到5.47 g/L,是SsXR的1.23倍,且对D-半乳糖转化率为54.7%,高于大多数基于异构化途径的报道.该研究为基于氧化还原途径的D-塔格糖高效生物合成工艺开发奠定了基础.