草鱼呼肠孤病毒衣壳蛋白VP7真核重组质粒的构建及免疫效果评价

THE CONSTRUCTION OF PEGFP-N1-VP7 CONTAINING GCRVVP7 GENE AND STUDIES ON ITS IMMUNE EFFICACY

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摘要为研究开发草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)基因疫苗,以编码其主要衣壳蛋白VP7的序列为靶基因,克隆构建了真核表达重组质粒 pEGFP-N1-VP7。用脂质体法将其转染真核细胞COS-1和CIK进行瞬时表达,荧光显微镜观察及特异性RT-P C R检测结果表明,成功转染并得到了高效表达。大量扩增重组菌,提取并制备重组质粒pEGFP-N1-VP7,肌肉注射免疫(20±5) g的健康草鱼,重组质粒按0.5和5μg分为2组,同时设5μg空载体组及对照组。免疫草鱼22d后,检测草鱼肠、外周血、肾脏、脾脏的呼吸暴发活性及淋巴细胞的增殖反应；免疫草鱼21d、28d、35d、42d、56d、70d、84d和98d后,分别尾静脉采血并分离血清,用双抗体夹心 ELISA 方法进行抗体水平的测定。结果表明,构建的含 VP7蛋白的核酸疫苗既可诱导草鱼的细胞免疫,又可诱导特异性体液免疫,具有明显的免疫应答作用。按照每尾0.5μg重组质粒的剂量免疫草鱼后35d进行攻毒,免疫保护率达到67%,此研究为GCRV基因疫苗的研制提供了实验资料。