过表达CXCL12基因的脂肪来源间充质干细胞的构建及其对内皮祖细胞趋化作用的实验研究

Construction of Lentiviral Vectors Carrying CXCL12 Gene and Exploration of Transfection Condition of Human Adipocyte-derived Mesenchymal Stem Cells

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摘要目的:本研究旨在构建携带间质细胞衍生因子1a (Stromal cell derived factor-1a,CXCL12/SDF-1a)基因慢病毒载体,探索CX-CL12慢病毒转染脂肪间充质干细胞(ADSCs)及CXCL12的表达,并观察其对内皮祖细胞的趋化作用.方法:利用PCR的方法从基因库调取并扩增CXCL12基因,克隆到穿梭质粒pLenO-GTP的表达框中,将重组pLenO-GTP载体质粒和慢病毒包装质粒共转染293T细胞,收获并测定病毒滴度,以最适MOI值转染ADSCs,通过western-blot方法测定转染的ADSCs表达的CXCL12,将过表达CXCL 12的脂肪干细胞移植到裸鼠背部,3天后流式细胞术鉴定外周血中的血管内皮祖细胞(EPC)的数量变化.结果:CXCL12基因PCR产物电泳与测序结果均正确.重组pLenO-GTP-CXCL12质粒酶切后产物电泳结果正确,含有CXCL12基因的穿梭质粒构建正确.穿梭质粒与慢病毒包装质粒共同感染293T细胞收获CXCL 12慢病毒.测得病毒滴度为1.4× 109 TU/ml.重组慢病毒感染ADSCs的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)值为50.western-blot检测结果慢病毒感染的ADSCs高表达CXCL12/SDF-1a,过表达CXCL12基因组裸鼠外周血EPC明显高于其余两组.结论:重组CXCL12慢病毒载体构建成功,包装得到高浓度病毒液,感染人ADSCs能稳定过表CXCL12蛋白,并可趋化骨髓内EPC进入外周血,为临床获取应用EPC提供了一种新的方法,为进一步研究过表达CXCL12的ADSCs,促进移植脂肪成活及血管化奠定基础.