换一批具蛋白酶抗性的Armillariella tabescens β-甘露聚糖酶MAN47的分子定向改造
Directional Molecular Rebuilding of 1-mannanase MAN47 with Trypsin-resistance from Armillariella tabescens
摘要利用定点突变的方法提高Armillariella tabescens f3-甘露聚糖酶MAN47的胰蛋白酶抗性.首先根据其氨基酸序列,找到胰蛋白酶的水解位点一赖氨酸( Lys,K)和精氨酸(Arg,R),再利用生物信息学软件获得酶分子结构中K和R与周围溶剂的接触程度,选定暴露程度最大的K280为候选突变位点,进行模拟突变,并分析突变前后的氢键键长和整体结构的变化.根据氢键键长的变化,确定突变体为K280N.对K280N设计突变引物,用重叠延伸PCR技术对MAN47野生型man基因进行突变,PCR产物与大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体PYCα连接,在大肠杆菌DH5α中扩增后转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,经人工肠液(pH 6.8 10mg/ml胰蛋白酶溶液)筛选,得到抗胰蛋白酶的最佳突变株.结果表明突变酶在用人工肠液处理180min后,其半衰期为173min,而野生型酶为99min,其他酶学性质与野生型酶基本一致.
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