水牛胎儿成纤维细胞电转染条件的优化

Optimization of Electroporation Condition for Buffalo Fetal Fibroblast Cells

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摘要高活力的转基因细胞的制备是转基因克隆动物研究的关键环节.为了高效制备转基因细胞,外源基因转入水牛胎儿成纤维细胞的条件需要优化.采用组织块贴壁法分离获得水牛胎儿成纤维细胞,经染色体核型分析表明获得的细胞具有正常的生物学功能,可用于细胞转染.采用电穿孔法将载体EGFP-N1导入水牛胎儿成纤维细胞,分别比较不同电压(200V,250V,300V,350V)、不同电击时间(5ms,10ms,15ms)和不同细胞代数(第3代、第5代、第10代)的转染效率,并利用优化的电转染条件将乳腺特异性表达的水牛促乳素(PRL)基因导入水牛胎儿成纤维细胞,G418筛选获单克隆并进行鉴定.结果发现电压为300 V,脉冲时间为10 ms时,细胞GFP阳性率为35.5％,转染效率较高.随传代次数的增加,细胞的转染效率下降；传至第10代的细胞转染效率显著低于第3代的水牛胎儿成纤维细胞(30％ VS 35.5％,P＜0.05).运用优化条件转染、筛选可获得转PRL单克隆细胞,转染效率为2.1×10-5(84/4×106).挑取单克隆细胞扩大培养,经PCR鉴定和核型分析,证实单克隆稳定整合促乳素基因,并且核型分析正常,可作为核供体,用于生产水牛转基因克隆胚胎.为采用体细胞克隆技术生产水牛转基因胚胎奠定了基础.