换一批rhIL-12二硫键、N-糖基化位点及C端氨基酸序列分析
Analysis of rhIL-12 Disulfide Bond And N-glycosylation Sites and C-terminal Amino Acid Sequence
摘要重组人白细胞介素12(rhIL-12)是一种已经用于治疗肿瘤,寄生虫、病毒性感染及造血障碍等疾病研究的异二聚体糖蛋白.结构确证是质量控制的重要内容,此研究对CHO细胞表达的rhIL-12二硫键配对方式、N-糖基化位点以及C端氨基酸序列进行了分析,使用Trypsin、Chymotrypsin和Glu-C三种酶分别对rhIL-12进行非还原酶解,尽可能地在其所有半胱氨酸残基之间断裂而形成二硫键相连的肽段,然后使用LC-MS/MS对酶解后的肽段样品进行分析,确定了rhIL-12样品中存在和理论配对方式相符的7对二硫键.将rhIL-12二硫键还原后并烷基化修饰保护,分别采用Trypsin,Chymotrypsin和GluC进行酶解,并用LC-MS/MS对酶解后肽段进行了质谱肽图及C端氨基酸序列分析,确定了rhIL-12 p35亚基C端氨基酸序列的8个氨基酸、p40亚基C端氨基酸序列的15个氨基酸.对rhIL-12样品还原及烷基化后用Trypsin变性酶解,所得肽段在H2O及H218O水中分别用PNGase F糖苷酶处理酶切产物.并通过二级质谱分析脱糖后糖肽段分子量变化,从而确定了rhIL-12的3个N糖基化修饰位点,分别为p35亚基的71位和85位以及p40亚基的200位.通过建立酶解结合二级质谱鉴定的方法,证明了新药rhIL-12的二硫键位点、C端氨基酸序列和糖基化位点与理论一致.
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关键词
rhIL-12二硫键N-糖基化位点C端氨基酸序列LC-MS/MSrhIL-12 disulfide bone N-glycosylation sites C-terminal amino acid sequence LC-MS/MS
医学主题词
糖基化(Glycosylation)氨基酸序列(Amino Acid Sequence)序列分析, 蛋白质(Sequence Analysis, Protein)研究(Research)配对(Pair Bond)
分类号
Q517（蛋白质）
栏目名称
DOI
10.13523/j.cb.20140506
发布时间
2014-06-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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