换一批凝乳酶原(凝乳酶)二硫键Cys206-Cys210的定位突变
Site-directed Mutagenesis at Disulfide Bond Cys206-Cys210 of Prochymosin (Chymosin)
摘要在对凝乳酶原二硫键Cys206-Cys210进行定位突变过程中发现,在相应的模板序列中有自身形成自由能为-16.1kcal/mol的茎环结构倾向,妨碍与引物结合,从而难以合成突变的DNA,采用快退火可解决此矛盾.5个突变基因均能在大肠杆菌中高效表达,除C206A外,约占细胞总蛋白的50%左右.突变体的复性结果表明,Cys206-Cys210对凝乳酶原正确折叠不是绝对必需的,但相应位置的氨基酸取代对复性效率有显著影响,在5个突变体中,C206A/C210A的复性率分别为C206S/C210S、C210A、C210S的4.5倍、20倍和30倍,而C206A完全不能复性.C206A/C210A与C206S/C210S的远紫外CD光谱与野生型基本相同,其荧光发射光谱与野生型相比最大发射峰不变,而荧光强度有显著增加.由于上述3个蛋白具有相同比活,说明突变分子能形成具有生物活性的空间构象,而只是某些色氨酸残基微环境受到微扰.
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