Flt-1胞外Ⅲ区蛋白的可溶性表达、纯化及活性测定

Soluble expression, purification and activity analysis of extracellular domain Ⅲ of Flt1

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摘要本研究旨在克隆和表达人血管内皮生长因子受体-1胞外Ⅲ区蛋白,并测定其生物学活性.应用RT-PCR法从人脐静脉内皮细胞中克隆Flt-1胞外Ⅲ区基因片段,经测序鉴定后再克隆到原核表达载体pAYZ中,构建出的表达载体pAYZflt-1 Ⅲ转化大肠杆菌16C9后,用低磷培养基诱导表达目的蛋白;采用E-tag亲和层析柱纯化目的蛋白;用SDS-PAGE、Western blotting和BCA法对其进行定性、定量检测鉴定;用ELISA、损伤愈合试验和Transwell法检测靶蛋白生物学活性.克隆的Flt-1胞外Ⅲ区基因经测序鉴定正确.所构建的pAflt-1Ⅲ表达载体经低磷培养基诱导后高表达出可溶性Flt-1胞外Ⅲ区蛋白,产量约为1.1 mg/L;ELISA结果显示该蛋白可以结合VEGF165,并表现为剂量依赖性,其与配体结合的解离常数Kd为1.180 pmol/L.损伤愈合试验和Transwell结果显示该蛋白可以抑制VEGF165(50 ng/ml)和bFGF(100ng/mL)诱导的脐静脉内皮细胞的迁移,并呈剂量依赖性.这将为今后开展人flt-1基因Ⅲ区的功能研究及其单抗研制奠定了实验基础.