换一批O-GlcNAcase抗原片段的选择、优化表达和多克隆抗体的制备
Antigen selection, optimized expression and polyclonal antibody preparation of O-GlcNAcase
摘要为了探讨O-GlcNAc修饰的生物学作用和相关疾病的发病机理,需制备高效、专一的O-GlcNAcase (OGA)抗体.通过对人源OGA蛋白进行序列分析发现,氨基端1～350 aa片段(sOGA)抗原性和亲水性较强,将该片段构建至原核表达载体pET-28a,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行诱导表达,通过优化IPTG浓度(0.05 mmol/L)和诱导时间(10 h)获得了高可溶性表达的重组蛋白酶.采用Ni-NTA亲和层析和分子筛层析对重组蛋白进行了纯化,SDS-PAGE检测分子量的大小(45kDa)和纯度(95%以上).以4-MU-O-GlcNAc为荧光底物,检测到sOGA的糖苷酶活性为106nmol/(min·mg),表明该片段是OGA糖苷酶的活性区域.以此片段作为抗原免疫新西兰大白兔,以CNBr活化Sepharose4B微珠纯化抗血清制备OGA特异性多克隆抗体.Western blotting和ELISA检测表明,该抗体可以特异识别含有OGA糖苷酶活性区域的多种变体,检测灵敏度为0.11ng/mL(效价为1:80000),可应用于O-GlcNAcase生物功能研究.
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