换一批
换一批亚位点+1处突变提高软化类芽胞杆菌环糊精糖基转移酶底物麦芽糊精特异性
Improving maltodextrin specificity by site-saturation engineering of subsite +1 in cyclodextrin glycosyltransferase from Paenibacillus macerans
摘要通过改造来源于软化类芽胞杆菌Paenibacillus macerans的环糊精糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase,CGT酶)的+1亚位点提高其对麦芽糊精的底物特异性,并进一步提高以麦芽糊精为糖基供体催化合成2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)的效率.首先对+1亚位点附近的3个氨基酸残基Leu194、Ala230和His233分别进行定点饱和突变,得到3个优势突变体L194N(亮氨酸→天冬酰胺),A230D(丙氨酸→天冬氨酸),H233E(组氨酸→谷氨酸),然后以这3个优势突变体为模板进一步进行两点和三点复合突变,获得7个复合突变体.研究结果表明,突变体L194N/A230D/H233E以麦芽糊精为底物合成AA-2G的产量最高,达到1.95 g/L,比野生型CGT酶提高了62.5％.对获得的突变体进行动力学分析,发现高浓度的底物L-AA对突变型CGT酶催化的酶促反应具有抑制作用.确定了突变体酶促反应的最适温度、pH和反应时间.模拟突变体的三维结构并进行分析,突变体底物特异性的改善可能与CGT酶第194位、230位和233位的氨基酸残基的亲水性及与底物分子间的作用力的改变有关.
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关键词
环糊精糖基转移酶L-抗坏血酸麦芽糊精2-O-D-吡喃葡糖基-L-抗坏血酸定点饱和突变cyclodextrin glycosyltransferaseL-ascorbic acidmaltodextrin2-O-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acidsite-saturation mutagenesis
栏目名称
DOI
10.13345/j.cjb.130401
发布时间
2014-03-07
基金项目
111工程（111-2-06）；
江苏省科技支撑计划项目（BE2011624）；
111 Project（111-2-06）；
the Key Technologies R & D Program of Jiangsu Province,China（BE2011624）
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