换一批新冠病毒主蛋白酶特异性荧光底物ddRFP-M的制备与鉴定
Preparation and characterization of a fluorogenic ddRFP-M biosensor as a specific SARS-CoV-2 main protease substrate
摘要传统的新冠病毒主蛋白酶(main protease,Mpro)多肽底物具有制备成本高、稳定性差和合成工艺复杂等缺点,积极开发廉价稳定的新型底物具有重要意义.本研究基于二聚化红色荧光蛋白(dimerization-dependent red fluorescent protein,ddRFP)原理,以AVLQS为连接肽,利用基因工程技术制备Mpro特异性荧光底物ddRFP-M,用于Mpro抑制剂的药理活性评价.将连接肽基因插入到密码子优化的RFP-A1与RFP-B1基因之间,构建ddRFP-M基因,再将其克隆到pET-28a载体中构建重组质粒.将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,以卡那霉素抗性法筛选重组子.重组子经低温诱导后,在大肠杆菌中进行荧光底物 ddRFP-M 的可溶表达,并以 HisTrapTM层析柱进行分离纯化.以荧光动力学检测法和电泳法测定ddRFP-M的底物特异性,并利用荧光底物 ddRFP-M 评价恩赛特韦和黄芩素的药理活性.结果显示,荧光底物 ddRFP-M 在大肠杆菌中呈可溶表达并成功进行了分离纯化,其具有良好的底物特异性、灵敏性和可靠性.新冠病毒 Mpro特异性荧光底物ddRFP-M的制备,为新冠病毒Mpro抑制剂的药理活性评价奠定了基础.
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关键词
新冠病毒主蛋白酶荧光底物二聚化红色荧光蛋白恩赛特韦黄芩素SARS-CoV-2main proteasefluorogenic substratedimerization-dependent red fluorescent proteinensitrelvirbaicalein
栏目名称
DOI
10.13345/j.cjb.230502
发布时间
2024-11-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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