摘要本研究旨在提供一种非动物源纳米抗体文库设计、合成及筛选方案,探索框架区的选择及互补决定区(complementarity determining region,CDR)的设计对于合成纳米抗体文库的影响,为增加合成纳米抗体文库的有效性、多样性及实用性奠定理论和技术基础.本研究基于天然纳米抗体的高通量测序结果,确定了 1个新的框架(IGHV3S65*01-IGHJ4*01),依据CDR中每个位置氨基酸的出现频率,分别设计简并引物,通过重叠延伸PCR(overlap PCR)合成纳米抗体编码片段.经过40次电转化,获得了包含6×109个克隆的全合成纳米抗体文库(single-frame synthesized nanobody library,SS-Library),经辅助噬菌体M13K07救援后,展示文库滴度为1013 PFU/mL.随机挑取48个单菌落进行菌落PCR验证,插入率达95.8％,Sanger测序结果显示38个克隆序列完整,均未见半胱氨酸以及终止密码子,且未出现完全相同的序列,提示文库多样性良好.以牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AchE)、小鼠 IgG(immunoglobulin G,IgG)为靶标,对文库进行筛选验证,分别获得了 2种针对BSA、10种针对AchE以及15种针对IgG的纳米抗体.每种抗原分别挑取了 1个阳性克隆进行重组表达,结果表明3种纳米抗体均为可溶性表达.采用间接酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和生物膜干涉技术(bio-layer interferometry,BLI)对重组表达纳米抗体结合活性进行了测定,结果表明,抗AchE和IgG的纳米抗体可以特异性结合相应抗原,亲和力常数分别为294 nmol/L和250 nmol/L.本研究提出的纳米抗体合成文库制备方法简单易行、偏好性低,有望成为一种通用的纳米抗体发现平台,用于先导特异性纳米抗体的制备与开发.