摘要本研究旨在制备猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)膜蛋白Mhp271的多克隆抗体(polyclonal antibody,pAb)并系统评价其免疫学特性及潜在应用价值.首先通过PCR技术扩增获得mhp271基因片段(3 156 bp),将其克隆至原核表达载体pMAL-c5x中构建重组表达质粒pMAL-c5x-mhp271.经PCR鉴定和DNA测序验证正确后,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,通过IPTG诱导表达重组Mhp271蛋白(rMhp271).Western blotting结果显示,rMhp271在160 kDa处呈现特异性条带,表明该重组蛋白成功表达.将纯化的rMhp271蛋白乳化后经3次免疫BALB/c小鼠,并在第3次免疫1周后采血,分离血清获得抗Mhp271蛋白pAb.为评价该pAb的反应原性,建立Mhp体外感染猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)模型,感染12 h后分别采用 Western blotting和间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)进行检测.Western blotting 结果显示,在 Mhp 感染的PAMs细胞裂解物中可见118 kDa特异性条带,而未感染对照组未检测到相应条带;IFA检测结果显示,Mhp感染组细胞中出现明显的绿色荧光信号,未感染对照组则无荧光信号.进一步通过体外封闭试验评估抗Mhp271蛋白pAb的抗Mhp感染潜力.将Mhp分别与100倍稀释的抗Mhp271蛋白pAb(实验组)或阴性血清(对照组)预孵育30 min后,接种至PAMs细胞并培养12 h,TaqMan实时荧光定量PCR检测结果显示,实验组Mhp载量较对照组显著降低;IFA检测发现实验组荧光信号强度明显减弱.本研究制备的抗Mhp271蛋白pAb具有良好的反应原性和抗感染活性,可用于Western blotting、IFA等免疫学检测方法.