换一批摘要主要采用了绝对定量PCR和热不均一交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR),检测了体细胞核移植技术生产的绿色荧光蛋白转基因猪中外源基因拷贝数和整合位点,并利用旁侧PCR(Juncuion PCR)对整合位点进行确定,同时进一步分析了整合位点的纯合性.结果表明,绝对定量PCR可以准确有效地检测外源基因拷贝数,标准曲线为:log_2N(拷贝数)=-0.935 4△Ct+3.411 6(R~2=0.997 4,P＜0.001),两只转基因猪中外源基因拷贝数分别为30.85±1.77和18.87±1.34;TAIL-PCR能成功地克隆转基因猪中外源基因整合位点,得到25条特异性条带,经BLAST比对,共获得TgInS1(1440 bp)、TgInS2(1263 bp)和TghIs3(1861 bp)3个整合位点.以整合位点侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合引发Junction PCR,得到预计大小的特异性片段,确定了整合位点上、下游侧翼序列的准确性.采用整合位点5'游和3'下游侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合,进行Junction PCR,在两只转基因猪中都得到与野生型猪一致的侧翼序列特异性引物扩增片段,表明我们获得的转基因猪都为整合位点杂合子.初步建立了绝对定量PCR和TAIL-PCR对外源基因拷贝数和整合位点检测的体系,为今后研究外源基因在转基因猪中遗传和表达的稳定性打下了基础.
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关键词
转基因猪拷贝数整合位点绝对定量PCRTAIL-PCR纯合性transgenic pigcopy numberintegration siteabsolute quantitative PCRTAIL-PCRzygosity
分类号
Q7（分子生物学）
栏目名称
DOI
10.3724/SP.J.1206.2009.00326
发布时间
2010-03-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
转基因生物新品种培育科技重大专项（(2008ZX08006-002,2009ZX08006-0018)）
东北农业大学"创新团队"发展计划资助项目. This work was supported by grants from The State Transgenic Research Program of China（(2008ZX08006-002, 2009ZX08006-001B)）
:Innovative Research Team of NEAU
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