换一批以EV713Cpro为靶标的抗病毒药物筛选模型的建立及抗3Cpro化合物筛选
Establishment and Application of High-throughput Screening Model for Antiviral Agents Targeting EV71 3Cpro
摘要建立一种以EV71 3C蛋白酶为靶标的抗肠病毒药物筛选模型,并应用于小分子化合物库筛选具有抗EV71活性的化合物.从临床手足口病例标本中分离肠道病毒进行PCR鉴定及基因组测序.通过插入突变在黄色荧光YFP编码框合适位点处引入EV71 3C酶切位点,构建对3C蛋白酶敏感的报告质粒pcDNA3-mYFP,然后将其与表达3C的质粒共转293A细胞,在3C抑制剂Rupintrivir存在与否的情况下通过荧光显微镜和酶标仪检测Ex(500nm)/Em(53 5nm)荧光信号的变化,判断建模是否成功;利用建好的筛选模型在高通量药物筛选平台对小分子化合物库进行初筛和复筛;再利用空斑分析检测筛选出的活性化合物是否对临床分离的EV71毒株具有抑制作用.mYFP在293A细胞中表达良好,3C的表达使荧光信号下降80％,Rupintrivir的存在则几乎不影响荧光表达,说明以3C为靶位的筛选模型构建成功.经过高通量初筛和复筛从26 000多种小分子化合物中获得26种能够显著回复mYFP表达的活性化合物;空斑分析显示其中2种化合物具有较为明显的抑制EV71复制的活性.因此,我们所构建的3C-mYFP共表达系统是一种简便有效的、可用于高通量筛选抗EV71 3Cpro药物的筛选模型.
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关键词
手足口病肠道病毒71型3C蛋白酶高通量筛选抗病毒药物hand foot and mouth disease (HFMD)enterovirus 713C proteasehigh throughput-screeningantiviral drugs
栏目名称
DOI
10.16476/j.pibb.2017.0167
发布时间
2017-10-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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