换一批正交设计优化绿竹ISSR-PCR体系和引物筛选
Optimization of ISSR-PCR Reaction System on Dendrocalamus oldhami by Orthogonal Design,and Selection of Primer
摘要旨在建立绿竹ISSR-PCR最佳反应体系和扩增程序,并筛选适于绿竹ISSR-PCR分析的高多态性引物.以绿竹基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用正交试验方法,对dNTPs浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、模板DNA用量设计5因素4水平试验,采用极差分析法和方差分析法对试验结果进行分析.并对退火温度和循环次数进行筛选,建立绿竹ISSR-PCR最佳反应体系和扩增程序.并利用优化后的体系对100条ISSR引物进行筛选.最终确定的最佳反应体系为:20μL的扩增体系中,dNTPs浓度为0.2 mmol/L,Mg2+浓度为2.0 mmol/L,TaqDNA聚合酶浓度为1.5 U,引物浓度为0.4μmol/L,DNA浓度为60 ng,10×PCR Buffer体积为2μL、剩下用灭菌ddH2O补全.各因素影响大小依次是:Mg2+>dNTPs>模板DNA>Taq DNA聚合酶>引物.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,(根据引物的退火温度)复性30 s,72℃延伸90 s,循环38次,72℃延伸10 min,4℃保存.以此体系为基础进行引物筛选,在100条ISSR引物中筛选出14条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物.
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关键词
绿竹ISSR正交试验设计反应体系扩增程序引物筛选Dendrocalamus oldhami(Munro)ISSRorthogonal designreaction systemamplifying procedureprimer screening
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DOI
10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0004
发布时间
2017-08-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
福建省农业科技重点项目（2013N0002）；
福建省农业科技重大项目（2011N5002）
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