换一批
换一批L-天冬氨酸-α-脱羧酶的重组表达、定点突变及高通量检测方法的建立
Recombinant Expression and Site-directed Mutagenesis of L-aspartate-α-decarboxylase,and the Establishment of High-throughput Assay Method
摘要将枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸-α-脱羧酶基因进行了克隆和异源表达,并通过定点突变构建了2个突变体.针对该酶活力检测时存在的检测通量低、周期长和成本高等缺点,旨在建立一种简单高效的酶活力高通量检测方法.采用氯酚红(CPR)指示剂和4-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液体系,并对检测条件进行优化,提高检测的准确性和灵敏性,建立了基于比色法的微孔板高通量检测方法,然后以L-天冬氨酸-α-脱羧酶及其突变体作为模型酶,对高通量检测方法进行了验证.优化后的酶活检测条件为MES缓冲液2 mmol/L,CPR指示剂75μmol/L,L-天冬氨酸75 mmol/L,pH 6.5,温度37℃,反应时间10 min,检测波长为567 nm.采用3种模型酶对微孔板高通量检测方法进行了验证,结果显示该方法与HPLC法测得的结果一致.高通量检测方法具有操作简便易行、灵敏度高等优点,能够用于L-天冬氨酸-α-脱羧酶的快速检测.该方法的建立将为L-天冬氨酸-α-脱羧酶进行定向进化及突变体的高通量筛选奠定基础.
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