换一批杰氏棒杆菌L-天冬氨酸α脱羧酶半理性改造及全细胞催化合成β-丙氨酸
Improving the Activity of L-aspartate-a-decarboxylase from Corynebacterium jeikeium Through Semi-rational Design and Whole-cell Catalytic Synthesis of β-alanine
摘要β-丙氨酸是多个药物合成的重要砌块,可以通过天冬氨酸α脱羧酶(PanD)催化L-天冬氨酸脱羧来合成,但普遍在用的PanD酶活性不高是制约全细胞催化合成β-丙氨酸的瓶颈.因此,本研究通过酶的挖掘,选择将杰氏棒杆菌来源(Corynebacterium jeikeium)PanD在Escherichia coli中异源表达.对杰氏棒杆菌来源PanD进行AlaphFold2 建模和分子对接,采用Rosetta虚拟突变确定突变热点,结合薄层层析初筛和纯化后复筛,最终筛选到突变体L39A,其比酶活为 13.45 U/mg,相比野生型酶的比酶活(9.6 U/mg)提升了 1.4 倍.酶学性质表征数据表明,野生型酶和L39A突变体最适pH均为 6.5,且在pH 6.0-7.0 之间酶活性稳定;两者最适温度为 55℃,但L39A热稳定性较野生型提高;突变体酶的催化效率比野生型提升了 1.4 倍.对突变体进行结构解析发现,39 位取代为侧链基团更小的丙氨酸,亲水性增强,增加了关键催化氨基酸 58 位酪氨酸与其他氨基酸的相互作用,使活性中心周围的区域稳定性提高,从而提高了催化活性.全细胞催化数据表明,在OD600=40 的菌体浓度下,L39A在 4 h能够转化 70%的L-天冬氨酸,而野生型 4 h仅能转化约 50%,L39A在 10 h能够转化 90%L-天冬氨酸,在 12 h能够完全转化 1 mol/L的L-天冬氨酸,这种全细胞转化效率的提升在 1.5 mol/L的底物条件下更加明显.本研究筛选到的突变体具有工业化应用潜力,建立了绿色、高效的β-丙氨酸生物合成法,为生物法大规模合成β-丙氨酸提供了重要的技术基础.
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DOI
10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2023-0085
发布时间
2023-10-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
国家自然科学基金（32171420）
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