换一批基于CRISPR/LanCas9的水稻基因编辑系统的开发和优化
Development and Optimization of Genome Editing in Rice with CRISPR/LanCas9 System
摘要[目的]在水稻中建立CRISPR/LanCas9 和 CRISPR/SLanCas9 基因编辑系统,扩展CRISPR/Cas基因编辑工具箱.[方法]将来自动物乳酸杆菌KCTC 3501 的LanCas9 进行密码子优化,并且进一步通过蛋白融合重组LanCas9 和SpCas9 的活性结构域形成嵌合体SLanCas9,分别构建CRISPR/LanCas9 和CRISPR/SLanCas9 编辑工具;以OsWRKY45、OsCPK4、OsCPK6、OsCPK7、OsMPK8、OsGSK3、OsGSK4为靶基因,在NGG PAM或者NAG PAM设计 20 nt或者 24 nt的sgRNA,通过水稻遗传转化,检测分析其编辑效率.[结果]LanCas9 在水稻中可以识别NGG PAM,结合 20 nt的sgRNA编辑效率更高,对OsWRKY45 基因的编辑效率为 25.00%;融合的SLanCas9 不仅能够识别NGG PAM,在NAG PAM位点也有一定的编辑效率,在不同PAM位点的编辑效率分别可达 100%和 39.58%.此外,SLanCas9 还具有多重基因编辑能力,在NGG PAM位点的多重基因编辑效率高达 74.07%.[结论]开发了具有自主知识产权的新型CRISPR/LanCas9 和CRISPR/SLanCas9 基因编辑技术.
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