换一批根癌农杆菌甲氧基脱甲基酶Atu1420的酶学特性表征和定向进化
Enzymatic Characterization and Directed Evolution of Agrobacterium tumefaciens O-demethylase Atu1420
摘要[目的]原儿茶酸是一种应用广泛的酚类化合物,生物合成法生产原儿茶酸是替代高污染的化学合成法的潜在方案,寻找和改良合成原儿茶酸的酶是生物合成法的关键.根癌农杆菌甲氧基脱甲基酶Atu1420是一种能够将香草酸转化为原儿茶酸的酶,本研究旨在表征Atu1420的酶学特性,并对其进行改良.[方法]通过大肠杆菌表达了Atu1420,并利用高效液相色谱等方法测定了Atu1420的酶学特性.基于Atu1420的预测结构和催化机制,选择了19个位点对Atu1420进行了定点突变,利用4-氨基安替比林开发了一种可视化检测Atu1420催化活性的方法,用于筛选Atu1420定点突变的变异体.利用alphaFold对Atu1420变异体的结构进行预测,分析了变异体催化效率提升的潜在机制.[结果]确定了Atu1420的Vmax为33.5±1.6 nmol/(L·s),米氏常数Km为82.7±3.5 μmol/L,转换数kcat为(6.7±0.3)×10-1 s-1,kcat/Km为8.1×10-3 L/(μmol·s),最适pH在7-8之间,最适温度为30℃.本研究在定点突变的变异体中筛选出了5个酶活力增强的变异体,其中活力最强的变异体为G35S,其催化速度比野生型提高66.0%.对这5个位点进行组合突变,在酶活力方面并没有产生明显的叠加效应.结构的比对分析暗示121位精氨酸残基角度的偏转可能是造成变异体催化效率提升的原因.[结论]Atu1420的酶学特性得到了有效的表征,获得了5个催化效率提高的Atu1420变异体,变异体催化效率的提高可能是121位精氨酸残基角度的偏转造成的.
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关键词
甲氧基脱甲基酶酶学特性催化效率原儿茶酸香草酸O-demethylaseenzymatic propertiescatalytic efficiencyprotocatechuic acidvanillic acid
栏目名称
DOI
10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-0993
发布时间
2025-03-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
国家自然科学基金（32300151）
江苏省高等学校自然科学研究项目（21KJB180019）
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