换一批摘要[目的]蛋白质晶体衍射是结构生物学研究的重要方法,晶体的衍射分辨率直接决定了模型的精确度及应用可行性.需要采取多种策略组合优化蛋白质晶体质量,提高晶体的衍射分辨率.[方法]以催化芳基偶联反应的P450酶为研究对象,利用分子生物学技术构建原核表达系统,并通过镍柱亲和层析和体积排阻色谱等方法进行纯化.在结晶阶段,采用气相扩散法系统筛选了1 632种初始条件,以此为基础,重点对缓冲液pH值、沉淀剂种类与浓度等关键变量进行精细化筛选,并引入多种添加剂以改善结晶环境.进一步结合结构预测分析,对蛋白柔性区域进行理性截短设计,并尝试SUMO标签的融合表达以增强蛋白的稳定性.[结果]实现了P450蛋白在大肠杆菌中的高效可溶表达,并经两步纯化获得可用于结晶的高纯度蛋白.通过大规模结晶条件筛选与多轮优化,结合序列截短和SUMO标签融合等策略协同作用,晶体形态显著改善,由原来的微晶或无定形沉淀转变为外观规则、棱角清晰的单晶.晶体衍射分辨率由初始的10 ?显著提升至2.86 ?,获得了可用于高分辨率结构解析的优质晶体.[结论]使用多策略协同的方法成功改善了蛋白晶体形态,提高了蛋白晶体的衍射分辨率.
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关键词
蛋白结晶X射线衍射蛋白纯化蛋白表达细胞色素P450protein crystallizationX-ray diffractionprotein purificationprotein expressioncytochrome P450
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DOI
10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2025-0975
发布时间
2026-03-09（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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