基于微量DNA样本的简化甲基化文库构建方法研究

An μLtra-low-input RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing) library preparation method

二维码有效期 120s

摘要RRBS(简化甲基化测序)是一种有效研究DNA甲基化状态的测序方案.文库构建是该方案中最关键的实验步骤之一,RRBS文库构建往往因为酶切产物少,文库构建步骤繁多等因素,导致DNA起始量需要1 ug以上.然而很多来源于人的样本,如冰冻组织穿刺、石蜡切片、显微微切割等,都往往只能获得100 ng以下的DNA,无法满足常规RRBS文库构建的起始DNA总量要求,从而大大限制RRBS技术的应用范围.本研究主要探讨并设计了基于微量DNA样本(<100 ng)的RRBS文库构建策略,主要通过优化MspI酶切条件、DNA片段大小筛选、缩减反应步骤及减少DNA转移次数等技术手段,大大提高了DNA回收率,进而建立了2种有效使用微量DNA样品的RRBS文库构建方案(即EA-Method和WB-Method方案).EA-Method方案在处理100 ng左右的DNA时,有经济、快速、高效的特点,但文库质量略差于WB-Method方案;WB-Method方案可将DNA起始量降低至10 ng,并且文库质量高.为验证WB-Method方法的可靠性,研究人员选取了3种志愿者样本(全血和口拭子),采用WB-Method同时进行常量和微量RRBS文库构建,并进行Illumina Hiseq平台测序,数据通过生物信息分析得到微量RRBS检测的CpG,CHG,CHH中C碱基的甲基化比例与常量RRBS结果一致.同时,该方法可以大大降低DNA损耗及损伤,因而该方法可将RRBS技术应用到更广泛的样本类型中去,有效拓展RRBS的研究领域.

作者魏冬凯 ^[1] 南蓬 ^[2] 徐康萍 ^[3] 裘锋 ^[4] 学术成果认领

作者单位苏州贝斯派生物科技有限公司江苏苏州 215123;复旦大学生命科学学院上海 200438 ^[1] 复旦大学生命科学学院上海 200438 ^[2] 苏州贝斯派生物科技有限公司江苏苏州 215123 ^[3] 苏州贝斯派生物科技有限公司江苏苏州 215123;上海生物信息技术研究中心上海 201203 ^[4]

关键词二代测序 RRBS 简化甲基化 EA-M WB-M NGS RRBS Reduced Representation Bisulfite Sequencing EA-M WB-M

主题词甲基化(Methylation)方法(Methods)研究(Research)人(Persons)组织(Tissues)

分类号 Q78

栏目名称 研究快报

DOI 10.3969/j.issn.1672-5565.2017.01.201609001

发布时间 2017-05-08