换一批
换一批毕赤酵母GT1的原核表达与体外功能鉴定
Prokaryotic expression and function identification of Pichia pastoris GT1 in vitro
摘要为了开展体外互作实验,以pXMJ19质粒为载体构建pXMJ19-gt1-His重组质粒,通过单因素优化实验获得毕赤酵母甘油转运体GT1的最优表达宿主为C41(DE3);最优表达条件为OD600达到0.7时加入终浓度为0.1 mmol/L的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),于30℃、110 r/min诱导10 h.通过超速离心验证了部分GT1蛋白在大肠杆菌中位于细胞质膜上,并筛选得到针对GT1重溶解率最高的去垢剂NP-40.在去垢剂环境下通过镍离子亲和层析纯化得到GT1蛋白,然后利用等温滴定量热法体外检测其与甘油的结合能力,结果表明:GT1与甘油在体外相互作用产生放热反应,且测得其与甘油的平衡解离常数KD值为6.58μmol/L.实验说明原核表达的GT1蛋白具有活性,且与甘油的体外相互作用明显,为GT1以甘油为配体进行结晶以及解析其三维结构提供了研究基础.
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