换一批
换一批人源RNA解旋酶DHX34基因功能结构域缺失载体的构建及鉴定
Construction and identification of a functional domain defective vector of human RNA helicase DHX34 gene
摘要目的 分别构建人源RNA解旋酶DHX34基因不同功能结构域缺失的突变载体,测序分析和验证其在293T细胞中的蛋白表达.方法 以pECMV-hDHX34-3×FLAG-SV40-Puro(hDHX34)质粒为模板,根据同源重组克隆的技术原理设计不同功能结构域引物,通过聚合酶链式反应扩增片段,重组克隆到pECMV-MCS-3×FLAG-SV40-Puro空载上,经限制性酶切、重组、转化分别构建ΔNTD、ΔCTD、ΔRecA1、ΔRecA2、ΔHelicase、ΔOB、ΔWR载体.经测序验证后,利用脂质体转染293T细胞,Western blot检测各载体蛋白的表达.结果 测序结果与预期结果相符,证实人源RNA解旋酶DHX34基因不同功能结构域缺失的真核表达载体构建成功.核酸电泳结果显示,hDHX34及突变质粒ΔNTD、ΔCTD、ΔRecA1、ΔRecA2、ΔHelicase、ΔWR和ΔOB片段长度符合预期,证明质粒构建成功.Western blot结果显示,293T细胞分别转染ΔNTD、ΔCTD、ΔRecA1、ΔRecA2、ΔHelicase、ΔWR、ΔOB载体后,蛋白条带清晰可见且符合预期相对分子量,说明质粒转染成功,hDHX34及各突变质粒成功表达.结论 成功构建人源RNA解旋酶DHX34基因不同功能结构域缺失的突变载体,并验证了各载体的表达情况,为研究人源DHX34基因的生物学功能奠定基础.
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关键词
RNA解旋酶DHX34基因功能结构域缺失载体构建重组克隆限制性内切酶RNA helicaseDHX34 genedeletion of functional domainsvector constructionrecombinant clonesrestriction enzymes
分类号
Q78
栏目名称
DOI
10.13753/j.issn.1007-6611.2025.01.004
发布时间
2025-03-21
基金项目
国家自然科学基金（81802456）；
陕西省自然科学基金面上项目（2024JC-YBMS-691）
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