摘要目的 构建人肿瘤抑制因子p53 结合蛋白 2(tumor suppressor p53-binding protein 2,TP53BP2)的重组真核表达载体,转染人胚肾Expi293F细胞,获得高纯度的重组人全长TP53BP2 蛋白并对其进行生物学活性鉴定.方法 利用UniProt网站查询TP53BP2 基因序列,并进行Expi293F表达系统序列优化,通过同源重组连接至pcDNA3.1(+)-P2A-eGFP载体并进行双酶切和测序鉴定,通过转染试剂聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)将pcDNA3.1(+)-P2A-eGFP-TP53BP2 质粒瞬时转染至Expi293F细胞,荧光显微镜观察转染效率,收集实验组及对照组细胞,利用免疫印记试验(Western blot,WB)检测TP53BP2 重组蛋白表达水平.通过His标签纯化试剂盒及Superdex 200 10/300GL层析柱进行蛋白纯化,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)对纯化后重组蛋白进行鉴定.利用免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)检测重组人全长TP53BP2 蛋白与p65 蛋白结合情况.利用免疫荧光(immunofluorescence,IF)检测重组人全长TP53BP2 蛋白与p65 蛋白共定位.利用表面等离子体共振(surface-plasmon resonance,SPR)技术,检测纯化后的重组人全长TP53BP2 蛋白与TP53BP2抗体的相互作用.结果 经测序和双酶切鉴定,重组质粒pcDNA3.1(+)-P2A-eGFP-TP53BP2 构建成功.经荧光显微镜观察结果显示转染效率约为60%,WB结果表明TP53BP2 蛋白在Expi293F细胞中过表达,证明转染成功.SDS-PAGE结果表明纯化后重组蛋白纯度在90%以上,证明纯化成功.Co-IP结果表明,TP53BP2重组蛋白可与p65蛋白相互作用.IF结果表明,His标签蛋白、TP53BP2蛋白及p65蛋白存在共定位,表明三者之间存在相互作用.SPR结果表明,纯化的重组人TP53BP蛋白与TP53BP2 抗体具有较好的结合活性.以上结果均证明重组人全长TP53BP2 蛋白具有生物学活性.结论 成功构建了TP53BP2 基因真核表达载体并在人胚肾Expi293F细胞中成功表达出具有生物学活性的重组人全长TP53BP2蛋白,为进一步研究TP53BP2的结构和功能奠定了基础.