换一批人B7-H3基因的克隆及其重组蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化
Cloning of human B7-H3 gene and expression,purification of B7-H3 protein in Pichia pastoris
摘要目的:克隆人B7-H3(CD276)基因的完全编码区序列,在毕赤酵母中表达B7-H3重组蛋白并纯化.方法:应用RT-PCR从人肺癌A549细胞中克隆B7-H3基因的完全编码区序列并在3'端加入6×His标签基因,克隆于毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建表达质粒pPIC9K/B7-H3,以该质粒转染酵母菌株GS115,在含有不同浓度遗传霉素(G418)的YPD平板上进行筛选,然后挑取单克隆进行PCR鉴定,甲醇诱导表达鉴定结果为阳性的酵母重组子,表达产物通过离子交换柱纯化后经SDS-PAGE电泳和Western Blot进行检测.结果:应用RT-PCR从人肺癌A549细胞中获得约1 500bp、与目的基因大小相符的条带,且测序正确;构建的酵母表达质粒pPIC9K/B7-H3表达框正确无误;阳性酵母重组子表达产物经6×His标签纯化后,SDS-PAGE电泳显示在70kD处有与预期大小相符的蛋白条带,Western Blot显示该蛋白可分别与抗6×His单克隆抗体及抗人B7-H3抗体呈特异性反应.结论:成功克隆了人B7-H3基因的完全编码区序列,在毕赤酵母中表达并进一步纯化,为B7-H3在肿瘤发生、发展中的作用及机制研究奠定了基础.
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分类号
R73-3（肿瘤学实验研究）
栏目名称
DOI
10.3969/j.issn.1672-4992.2017.10.001
发布时间
2017-05-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
基金项目
国家自然科学基金（81572974）
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