摘要目的 建立可同时检测小鼠诺如病毒和轮状病毒的双重实时荧光 RT-qPCR 检测方法并对其进行方法学验证.方法 通过比对 NCBI公布的小鼠诺如病毒(MNV)及小鼠轮状病毒(MRV)基因组序列,分别选取 MNV VP1基因及 MRV NSP5 基因保守序列设计引物探针,通过优化引物及探针浓度,建立可在一次反应中同时检测小鼠诺如病毒和轮状病毒的 Taqman实时荧光 RT-qPCR检测方法.使用 MNV及 MRV的 RNA 标准品验证双重及单重方法的定量范围及最低检测限;MNV及 MRV RNA标准品各设 101～105 copies/μL 等 5 个浓度,等体积混合形成浓度矩阵,单因素方差分析比较不同浓度的 MNV及 MRV之间是否会对定量结果产生干扰;对 101,103,105 copies/μL 3个浓度的 RNA标准品进行批间及批内检测,验证方法的重复性;通过检测 544 份小鼠粪便样品验证方法实际应用性能,同时用普通 RT-PCR 法检测相同的 90 份小鼠粪便样品,卡方检验比较两种方法结果的差异.结果 建立的双重 RT-qPCR方法可在 101～108 copies/μL范围实现对MNV及MRV的有效定量,标准曲线各参数均在正常范围:R2 值均为 0.999,斜率(MNV-3.332,MRV-3.250)、扩增效率(MNV 99.6%,MRV 103.1%)、单重法标准曲线与双重法相似,各参数值差别不大;最低检测限分别为:MNV 单重及双重法均为 3.125 copies/μL,MRV 单重法为6.25 copies/μL,双重法为 3.125 copies/μL;批内各浓度Ct值变异系数为 0.63%～1.24%,批间变异系数为 3.60%～5.57%;干扰实验表明低浓度标准品的检测(MNV101～103 copies/μL,MRV 102 及 103 copies/μL)易受到高浓度对应模板的干扰,导致所测定量值偏高;用所建立的双重 RT-qPCR 检测临床样品,结果 MNV 阳性率为 1.8%(10/544),MRV未检出阳性样品.检测相同的 90 份小鼠粪便样品,双重实时荧光 RT-qPCR检出 10 份 MNV 阳性样品,普通 RT-PCR可检出 8 份;两种方法均可检出 1 份 MRV阳性样品,经卡方检验两者结果无统计学差异.结论 本研究所建立的双重实时荧光 RT-qPCR方法可用于实验小鼠中 MNV及 MRV的快速高效的常规健康监测.