3种药物对苯丙酮尿症PAH基因无义突变的通读效率比较

Comparisons of read-through efficiencies of three drugs on nonsense mutation of PAH gene in phenylketonuria

导出学术成果认领

摘要目的构建5个PAH基因无义突变位点慢病毒载体并转染细胞,比较3种不同类型药物PTC124、Amlexanox和G418对PAH基因无义突变的通读效率.方法选择5个突变频率较高的人PAH基因无义突变位点(R111X、Y166X、R176X、W326X、Y356X)构建慢病毒载体,与野生型慢病毒载体(6个载体均带有Flag标签DDDDK)分别转染HEK293细胞.取野生型(WT)及5种突变型细胞,采用不加药物(0 μmol/L)、PTC124(50、100 μmol/L)、Amlexanox(250、500 μmol/L)、G418(1、2、5 g/L)分别处理48 h,采用CCK-8实验检测72 h细胞增殖率,采用实时荧光定量PCR法检测DDDDK mRNA相对表达量,采用Western blot法检测PAH、DDDDK蛋白相对表达量.结果 (1)WT细胞经5 g/L G418处理72 h后细胞增殖率低于0 μmol/L(P＜0.05),其余药物及浓度处理后细胞增殖率均不受影响;5种突变型细胞经50、100 μmol/L PTC124处理72 h后细胞增殖率均不受影响;W326X、Y356X突变型细胞经500μmol/L Amlexanox处理72 h后细胞增殖率低于0 μmol/L(P＜0.05),其余突变型细胞经250、500 μmol/L Amlexanox处理后细胞增殖率不受影响;R111X、Y166X突变型细胞经5 g/L G418处理72 h后细胞增殖率低于0 μmol/L(P＜0.05),1、2 g/LG418处理后细胞增殖率不受影响,R176X、W326X和Y356X经1、2、5 g/L G418处理72 h后细胞增殖率均低于0 μmol/L(P＜0.05).(2)WT 细胞经 50、100 μmol/L PTC124 和 250、500 μmol/L Amleanox 处理后 DDDDK mRNA 及PAH、DDDDK 蛋白相对表达量均高于 0 μmol/L(P＜0.05),5 g/L G418 处理后均低于 0 μmol/L(P＜0.05),1、2 g/L G418处理后与0 μmol/L比较差异均无统计学意义(P＞0.05).5种突变型细胞经250、500 μmol/L Amleanox和5 g/L G418 处理后 DDDDK mRNA 相对表达量均高于 0 μmol/L(P＜0.05),经 50、100 μmol/L PTC124 处理后 DDDDK mRNA相对表达量与0 μmol/L比较差异均无统计学意义(P＞0.05);5种突变型细胞不加药物(0 μmol/L)处理后DDDDK mRNA相对表达量均低于WT细胞(P＜0.05).5种突变型细胞经不加药物(0 μmol/L)、50、100 μmol/L PTC124 和 250、500 μmol/L Amleanox 处理后几乎不表达 PAH、DDDDK 蛋白;R111X、R176X、Y166X、Y356X突变型细胞经5 g/L G418处理后PAH、DDDDK蛋白相对表达量均高于0 μmol/L(P＜0.05),W326X突变型细胞经1、2、5 g/L G418 处理后 PAH、DDDDK 蛋白相对表达量均高于 0 μmol/L(P＜0.05),1、2 g/L G418 均高于 5 g/L G418(P＜0.05),1 g/L G418与2 g/L G418比较差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 Amlexanox和G418可提高PAH基因5种无义突变R111X、Y166X、R176X、W326X、Y356X转录水平,其中G418可使5种无义突变表达完整PAH蛋白;G418矫正W326X无义突变的有效浓度为1 g/L,而矫正其余4种无义突变的有效浓度为5 g/L.