结核分枝杆菌抗原 HBHA 在耻垢分枝杆菌中的重组表达和鉴定

Recombinant Expression and Identification of Antigen Heparin-binding Hemagglutinin (HBHA) of Mycobacterium Tuberculosis in Mycobacterium Smegmatis

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摘要目的：构建高效表达结核分枝杆菌抗原肝素结合血凝素（HBHA）的重组耻垢分枝杆菌。方法针对结核分枝杆菌H37Rv株 HBHA的编码基因Rv0475设计特异引物，利用 PCR技术从细菌基因组中获取目的基因，并克隆入pET‐30b（＋）载体构建重组原核表达质粒pETHBHA ，经IPTG诱导pETHBHA 转化的重组 E.coli BL21（DE3）细菌， Ni柱纯化携带C‐端 His标签的HBHA蛋白，并制备鼠源多克隆抗体。PCR扩增含自身启动子和调节序列的Rv0475基因并克隆入大肠埃希菌‐分枝杆菌穿梭载体pMV261，构建重组分枝杆菌表达质粒pMVHBHA ，并经酶切鉴定证实后，电转化入耻垢分枝杆菌，涂布含卡那霉素的7H11平板，挑选抗性克隆并扩大培养，15％ SDS‐PAGE和Western blot鉴定重组耻垢分枝杆菌的表达。结果分别成功构建重组原核表达质粒 pETHBHA 和重组分枝杆菌表达质粒pMVHB‐HA ；重组蛋白 HBHA在大肠埃希菌中成功表达并纯化后，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定浓度为1.9125μg／μL ，用其制备鼠源多抗；证实HBHA利用其自身的启动子和调节序列在重组耻垢分枝杆菌中表达。结论成功构建过表达HB‐HA的重组耻垢分枝杆菌，为研究该蛋白参与结核病的致病机制和研发新型疫苗和诊断试剂奠定了基础。