胱硫醚β-合酶/胱硫醚γ-裂解酶-硫化氢体系小干扰RNA对大鼠正常肝细胞株BRL凋亡的影响

Small Interfering RNA of Cystathionineβ-Synthase/Cystathionineγ-Lyase-Derived Hydrogen Sulfide Synthesis Induces Apoptosis of Rat Hepatic BRL Cell Line

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摘要目的：探讨内源性胱硫醚β-合酶（CBS）/胱硫醚γ-裂解酶（CSE）-硫化氢（H2S）体系在生理状态肝细胞凋亡中的作用及其机制。方法培养大鼠正常肝细胞株BRL。小干扰RNA（siRNA）序列筛选：设阴性siRNA序列转染组（对照组）、CBS siRNA序列转染组（CBS 1~3序列组）和CSE siRNA序列转染组（CSE 1~3序列组），转染24、48 h；siRNA转染后检测细胞凋亡：设阴性对照组、溶剂对照组、CBS siRNA组、CSE siRNA组、（CBS+CSE）siRNA组，作用时间为转染后0、4、8、12、24 h；凋亡机制探讨：设阴性对照组、CBS siRNA组、CSE siRNA组、（CBS+CSE）siRNA组，作用时间为转染后4、8、12、24 h；每组均4个平行样。RT-PCR、Western blot检测BRL细胞中CBS、CSE mRNA和蛋白的表达，siRNA基因静默CBS、CSE，去蛋白法检测H2S生成，Hoechst荧光染色、流式细胞术检测BRL细胞凋亡，荧光染色检测线粒体膜电位（MMP）变化，Western blot 检测胞浆内细胞色素 C（Cyt C）和激活型 caspase 3（cleaved-caspase 3）蛋白表达变化。结果 BRL细胞株存在CBS、CSE表达。CBS/CSE siRNA转染后，细胞内源性H2S生成降低，凋亡细胞数量和细胞凋亡率随时间延长而逐渐增加，BRL细胞上清乳酸脱氢酶（LDH）活性均未见明显变化，MMP下降，胞浆内Cyt C蛋白表达上调，cleaved-caspase3蛋白表达上调。结论抑制内源性H2S体系可引起生理状态肝细胞凋亡，机制可能部分涉及凋亡线粒体途径。