miR-196b海绵吸附慢病毒载体的构建及其在骨髓基质细胞系ST2中的表达

Construction of miR-196b sponge lentiviral vector and its expression in bone marrow stromal cell line ST2

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摘要目的构建miR-196b海绵吸附慢病毒载体,为研究miR-196b在骨髓基质细胞系中的功能奠定基础.方法根据miR-196b的成熟体序列设计与之互补的串联的六重复序列设计成引物,通过PCR反应将该六重复序列亚克隆至pUC 19质粒中,再经酶切连接至pLVX-shRNA2慢病毒载体,利用293T细胞将构建成功的miR-196b海绵吸附慢病毒载体进行病毒包装和滴度测定,pLVX-shRNA2慢病毒作为对照组,miR-196b海绵吸附慢病毒作为实验组,将其感染ST2细胞,观察感染效率,并通过Western blotting检测miR-196b靶基因叉头框蛋白O1(FoxO1)的蛋白水平.结果酶切鉴定和测序结果正确,慢病毒包装所测滴度为1×108 PFU/mL,将其感染靶细胞,其感染效率达80％.Western blotting结果显示,与对照组相比,其靶基因FoxO1蛋白表达水平有明显增加(P＜0.05).结论成功构建了miR-196b海绵吸附慢病毒载体,并能有效吸附内源性的miR-196b,从而发挥其抑制作用.