基于狂犬病病毒G蛋白scFv介导的靶向shRNA制备与鉴定

Targeted inhibition of Rabies Virus replication in vitro by single chain antibody domain mediated vector expression shRNA delivery

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摘要[目的]探讨以狂犬病病毒G糖蛋白单链抗体介导的载体表达shRNA靶向制剂,靶向抑制狂犬病毒复制的可行性.[方法]应用PCR技术获得狂犬病毒G糖蛋白单链抗体scFv(G)和绿脓杆菌跨膜区-酵母DNA结合结构域ETA-GAL4基因,通过搭桥PCR法获得scFv(G)一ETA-GAL4(SEG)嵌合基因;克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达质粒pET28a(+)-scFv(G)-ETA-GAL4(pET28a-SEG);在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,利用镍柱亲和层析法纯化包涵体,经复性、鉴定制得SEG蛋白;ELISA法检测表达蛋白与狂犬病毒特异结合活性;将SEG蛋白与含shRNA的质粒(pRNATU6.3-shRNA)连接制成靶向shRNA,接入100 TCID50狂犬病毒感染BHK-21细胞,35 h观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达情况;48 h用直接免疫荧光抗体试验测定复合物抑制病毒效果.[结果]克隆得到1557 bp的SEG蛋白编码基因,大肠杆菌中成功表达57 KDa的SEG蛋白,能与抗His的单克隆抗体发生特异性反应,SEG蛋白经镍柱纯化、复性后得率为2.8 mg/mL.ELISA试验证明SEG蛋白在一定浓度范围内与RV结合呈正相关.细胞试验表明GFP在细胞内得到表达;直接免疫荧光试验测定该复合物能抑制76%病毒复制.[结论]SEG蛋白能与携带shRNA的质粒结合,可运送该质粒至RV感染BHK-21细胞中,抑制狂犬病毒的复制.

作者杨瑞梅 ^[1] 崔燕 ^[2] 杨松涛 ^[3] 王承宇 ^[3] 单虎 ^[4] 王化磊 ^[3] 夏咸柱 ^[3] 学术成果认领

作者单位甘肃农业大学动物医学院,兰州,760030;军事医学科学院军事兽医研究所,长春军事兽医研究所,长春,130062;青岛农业大学动物科技学院,青岛,266109 ^[1] 甘肃农业大学动物医学院,兰州,760030 ^[2] 军事医学科学院军事兽医研究所,长春军事兽医研究所,长春,130062 ^[3] 青岛农业大学动物科技学院,青岛,266109 ^[4]

关键词狂犬病毒单链抗体绿脓杆菌外毒素跨膜区基因运送 shRNA rabies virus single chain antibody pseudomonas exotoxin A translocation domain gene delivery shRNA

主题词蛋白(Egg White)狂犬病(Rabies)基因(Genes)单链抗体(Single-Chain Antibodies)狂犬病病毒(Rabies virus)

分类号 Q78

栏目名称

侵染和免疫

发布时间 2010-04-14

基金项目

国家高技术研究发展计划(863计划)（2006AA02Z456）；农业公益性行业项目（200803014）