关键基因的修饰对枯草芽孢杆菌尿苷合成的影响

Effect of key-gene modification on uridine biosynthesis in Bacillus subtilis

摘要[目的]探究磷酸核糖焦磷酸(PRPP)合成酶(prs)和氨甲酰磷酸合成酶(pyrAA/pyrAB)的点突变,以及异源5'-核苷酸酶(sdt1)的过表达,对枯草芽孢杆菌尿苷生物合成的影响.[方法]依据推断的变构位点,分别在prs基因和pyrAB基因编码序列中引入点突变;将点突变的prs基因在染色体xylR位点整合表达,pyrAB基因则在染色体原位被修饰;sdt1基因在染色体sacB位点整合过表达.通过对重组菌摇瓶发酵液中尿苷、胞苷和尿嘧啶的分析,表征相关基因修饰对尿苷合成的影响.[结果]在PRPP合成酶中引入Asn120Ser、Leu135Ile和Glu52Gly或Val312Ala点突变,分别导致尿苷积累量提高67％和96％.进一步在氨甲酰磷酸合成酶中引入Ser948Phe、Thr977Ala和Lys993Ile点突变,导致尿苷积累量又增加了182％,达到6.97 g/L.在此基础上,过表达异源5'-核苷酸酶,导致尿苷产量增加17％,达到8.16 g/L.[结论]PRPP合成酶和氨甲酰磷酸合成酶的酶活或反馈抑制调节机制,是限制尿苷过量合成的重要因素.PRPP合成酶的Asn120Ser和Leu135Ile点突变,以及氨甲酰磷酸合成酶的Ser948Phe、Thr977Ala和Lys993Ile点突变,能够显著促进尿苷合成.PRPP合成酶附加的Glu52Gly或Val312Ala点突变,有利于尿苷合成.异源的嘧啶专一性5'-核苷酸酶的引入,也对尿苷的合成有明显的促进作用.