嗜热细菌Anaerobaculum hydrogeniforman Pif1解旋酶的异源表达与解旋反应特性

Heterologous expression and characterization of unwinding reaction of Pif1 helicase from Anaerobaculum hydrogeniforman

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摘要[目的]原核表达与纯化源自嗜热细菌Anaerobaculum hydrogeniforman的Pif1解旋酶,从而探究其解旋反应特性.[方法]将重组载体pET21a-AnaPif1-TEV/SUMO导入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并进行Ni-NTA亲和层析、Superdex200凝胶过滤层析等一系列纯化手段;再利用快速停留监测技术系统地研究Ana.Pif1的解旋反应特性,包括解旋极性、最佳ATP浓度、最佳金属辅因子、最佳解旋温度以及解旋复制中间体DNA的底物特异性.[结果]通过异源表达与纯化,获得了无任何标签序列、分子量59 kDa的Ana.Pif1蛋白,纯度达97％,产率为9.5 mg/L.本研究首先验证Ana.Pif1具有5'-3'的解旋极性,并发现其解旋反应最佳ATP浓度为2 mmol/L,其最佳二价金属辅因子为Mg2+,最适反应温度为55℃.解旋复制中间体的底物特异性显示,Y-S型复制叉的解旋速率最高,为0.127 s-1;而12 nt-bubble底物的解旋幅度最大,达到78.8％;暗示这些底物可能是Ana.Pif1的天然底物.[结论]本文首次较为系统地分析了Ana.Pif1解旋酶的解旋反应特性,为阐明此类嗜热细菌Pif1解旋酶的分子作用机制奠定了基础.

作者段晓雷 ^[1] 刘娜女 ^[2] 张涛 ^[3] 曹睿 ^[4] 姜钧耀 ^[3] 闵迅 ^[3] 奚绪光 ^[2] 学术成果认领

作者单位遵义医学院附属医院检验科,贵州遵义563000;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100 ^[1] 西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌,712100 ^[2] 遵义医学院附属医院检验科,贵州遵义,563000 ^[3] 河南科技大学动物科技学院,河南洛阳,471003 ^[4]

关键词 Pif1解旋酶嗜热厌氧棒菌快速停留检测解旋特征参数

主题词热温度(Hot Temperature)细菌(Bacteria)氢(Hydrogen)复制技术(Copying Processes)研究(Research)

栏目名称

研究报告

DOI 10.13343/j.cnki.wsxb.20180214

发布时间 2019-04-09

基金项目

国家自然科学基金（31660241）；贵州省科技合作基础研究项目（黔科合基础[2018]1196）；遵义医学院博士科研启动资金（院字(2017)05）；遵义医学院大学生创新创业训练计划（ZKDC2018005）