摘要[目的]构建马赛菌(Massilia sp.)UMI-21来源乙酰辅酶A合成酶ACSMU和聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate,PHA)合酶PhaCMU的体外重组表达体系并过表达2种酶,利用体外合成体系确定2种酶在Massiliasp.UMI21聚3-羟基丁酸(polyhydroxybutyrate,PHB)合成途径中的主要功能.[方法]利用无缝克隆技术将来源于Massilia sp.UMI-21的乙酰辅酶A合成酶基因acsMU和PHA合酶基因phaCMU扩增后与pQE-80L质粒连接,转导大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)构建2个基因的重组表达体系;利用6×His标签纯化蛋白ACSMU和PhaCMU,并采用5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)[5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB]法测定其活性;使用体外单相合成系统(one-phase reaction system,OPRS),以(R)-3HB为底物,验证ACSMU和PhaCMU这2种酶在合成PHB途径中的功能.[结果]成功构建了 ACSMU和PhaCMU蛋白重组表达菌株BL21-pQE-80L-acsMU和BL21-pQE-80L-phaCMU,提纯得到过表达蛋白ACSMU和PhaCMU产率分别为24.8 mg/L和25.6 mg/L;ACSMU 酶比活力为(0.148±0.011)U/mg.PhaCMU 酶对(R)-3HBCoA 的比活力为(0.102±0.011)U/mg;核磁共振氢谱(nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy,1H-NMR)分析结果表明,使用ACSPt-PCTCP-PhaCRe、ACSMU-PCTCP-PhaCRe 和 ACSMU-PCTCP-PhaCMU 这 3 条 OPRS 途径均能合成PHB,产量分别为0.62、0.76和0.64 g/L.[结论]acsMU和phaCMU基因可利用大肠杆菌表达体系过表达并可获得具有活性的可溶性蛋白;对比ACSPt-PCTCP-PhaCRe合成体系,ACSMU替代ACSPt合成PHB产量增加22.58％,在聚合酶相同的情况下,PHB的合成产量依赖乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthase,ACS)合成乙酰辅酶A的稳定性.使用PhaCMU代替PhaCRe,对比ACSMU-PCTCP-PhaCRe组合,合成PHB产量减少了 15.79％.在聚合前体浓度相同的情况下,PHB合成量依赖聚合酶的活性.