摘要[目的]在大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655-△recA 和 Escherichia coli DH10B 中构建CRISPR/LshCas13a质粒干扰系统,通过靶向非必需基因lacZ和必需基因polA,分别分析RNA编辑实验中的逃逸现象.[方法]选取来自沙氏纤毛菌(Leptotrichia shahii)中的Cas13a蛋白编码基因LshCas13a,构建可诱导的CRISPR/LshCas13a的RNA编辑系统相关质粒,选取 MG1655-△recA和DH10B为研究对象.通过Crisporo算法,设计靶向lacZ和polA的CRISPR RNA(crRNA)序列,考察利用LshCas13a质粒干扰实验靶向lacZ和polA的逃逸现象.再通过对逃逸菌落的数量和序列分析评估LshCas13a系统的逃逸现象,结合PCR和Sanger测序技术探究LshCas13a系统的逃逸事件.选取通过插入序列(insertion sequence,IS)转座破坏LshCas13a系统的LshCas13a基因的逃逸菌落,通过监测OD600进一步考察菌株的生长情况.[结果]利用LshCas13a系统靶向MG1655-△recA 和 DH10B 中的 lacZ 和 polA,发现靶向 lacZ 时,MG1655-△recA通过 LshCas13a基因点突变和IS转座突变方式逃逸;靶向polA时,MG1655-△recA和DH10B通过点突变LshCas13a基因、IS转座和突变crRNA的直接重复(direct repeat,DR)序列等方式逃逸.LshCas13a编码基因的突变促进了菌株生长的恢复.[结论]本研究利用LshCas13a质粒干扰系统研究了 E.coli宿主RNA编辑中的多样化逃逸现象,包括了染色体编码的IS介导的LshCas13a转座突变、LshCas13a点突变、crRNA的DR序列突变或重组等情况.本研究为进一步优化CRISPR/LshCas13a基因编辑系统奠定了基础.