摘要[目的]从研究区域自然环境中获得目标微生物富集体并建立纯培养,完善甲烷渗漏区生物地球化学基础研究的关键环节,为其他未知微生物的富集与培养提供思路和借鉴.[方法]对甲烷渗漏区域海洋沉积物微生物进行分离和培养,提炼一套较为完善的海洋微生物实验方法,包括微生物样品现场处理、厌氧培养基配制与灭菌、微生物富集培养与分离等.利用微生物高通量测序技术进行基因测序与菌群鉴定,并设置不同的实验条件和实验周期,开展微生物活体培养实验.短期实验(1.5 d)采用单因子变量方法研究环境因素(光照、培养基浓度、温度、酸碱度)对微生物的影响;中期实验(22 d)验证短期实验结果,并确定更适宜的培养条件;长期实验(250 d以上)通过对微生物实时定量追踪,进一步研究微生物富集体在特定条件下的生长状况和活性表达.[结果]短期培养中,厌氧污泥菌液在自然光照下活性显著提升(17 h达峰值,铁浓度 16.7 mg/L,约为初始浓度 4 倍),黑暗环境则延长其缓冲期(0-15 h),而海洋底泥菌液在黑暗环境中活性更优(14 h/35 h出现高值),且在酸碱环境(pH 5.0/9.0)后期活性高于中性(铁浓度分别约为 4.3 mg/L vs.11.1 mg/L).中期培养阶段,厌氧污泥菌液在 4℃+酸性条件下活性稳定(铁浓度降幅仅为 20%),而海洋底泥菌液偏好较高温度及碱性环境(pH 9.0 适应后活性提升).全局分析显示,前 15 天为温度适应期,此后温度成为关键调控因子.长期培养中,厌氧污泥菌液活性呈周期性波动(每 50 d更换培养基引发先降后升),但 150 d后出现不可逆衰减;海洋底泥菌液则表现出强适应性(高压下 117-145 d活性达峰值,推测生长周期约为 130 d),且在室压下维持锯齿状稳定活性(铁浓度3.0-10.4 mg/L).[结论]厌氧污泥微生物对光照和培养基浓度敏感,短期光照促进活性,但长期抑制,黑暗及 100%浓度培养基更适其生长(4℃酸性环境,15 d生长周期);而海洋底泥微生物在黑暗+100%培养基、高温碱性环境下适应性更强,虽短期活性受光照影响小,但需约 130 d生长周期,其高压环境适应性显著影响生长进程.